Βιογενείς Αμίνες - Νευροδιαβιβαστές

Σκοπός

Οι γενετικές μεταλλαγές του μεταβολισμού των Νευροδιαβιβαστών αποτελούν μία ομάδα παιδιατρικών νοσημάτων με αυξανόμενη αναγνωρισιμότητα. Η αναγνώριση των νοσημάτων αυτών απαιτεί υψηλή Κλινική εξειδίκευση και στοχευμένη Βιοχημική ανάλυση. Η  έγκαιρη διάγνωση είναι καθοριστική και η θεραπεία που απαιτείται εξειδικευμένη.  

Απαραίτητο βήμα στη διάγνωση είναι  η ανάλυση των:

• 1. Βιογενών Αμινών (ΒΑ) στο ΕΝΥ: homovanillic acid (HVA): τελικός μεταβολίτης ντοπαμίνης, 5-hydroxy-indoloacetic acid (5-HIAA): τελικός μεταβολίτης σεροτονίνης, 3-ortho-methyldopa (3-OMD), 5-hydroxy-tryptophan (5-OHTrp).
• 2. Πτερινών (neopterin, biopterin) στο ΕΝΥ και τα ούρα: μεταβολίτες που εμπλέκονται στον μεταβολισμό της Tetrahydrobiopterin (BH4), απαραίτητης στον καταβολισμό των Αρωματικών Αμινοξέων (Φαινυλαλανίνη, Τυροσίνη, Θρυπτοφάνη).

Οι διαταραχές των Νευροδιαβιβαστών περιλαμβάνουν τα ακόλουθα κλινικά χαρακτηριστικά:

• Δυστονία, πτώση, μυοκλονική επιληψία
• Αστάθεια θερμοκρασίας-ύπνου, εφίδρωση, επιθετικότητα
• Επιληπτική εγκεφαλοπάθεια, μικροκεφαλία
• Πνευματική καθυστέρηση
• Νευροψυχιατρικά συμπτώματα

Αρχή της μεθόδου

Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται είναι εξειδικευμένες, ευαίσθητες και επιτρέπουν την ταχεία ανάλυση του δείγματος, με επαναληψιμότητα και με ελάχιστη προετοιμασία. Ο προσδιορισμός των ΒΑ πραγματοποιείται με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής πιέσεως (HPLC) και Ηλεκτροχημική ανίχνευση (ESAIII, Coulochem) και των Πτερινών (Neopterin, Biopterin)  με HPLC και φθορισμομετρική ανίχνευση.

Δειγματοληψία

Απαιτείται αυστηρό πρωτόκολλο δειγματοληψίας και αποθήκευσης των δειγμάτων του ΕΝΥ.

1. Στις πρώτες 5-10 σταγόνες της παρακέντησης γίνονται οι αναλύσεις ρουτίνας (αριθμός κυττάρων κλπ).

2. Οι επόμενες 10 σταγόνες (0.5-1.0 ml,  μπουκαλάκι 2) συλλέγονται για την ανάλυση των ΒΑ και επίσης οι επόμενες 10 σταγόνες (0.5-1.0 ml,  μπουκαλάκι 3) για την ανάλυση των Πτερινών.

3. Σε περίπτωση που κάποιο δείγμα είναι αιμολυμένο, πριν καταψυχθεί φυγοκεντρείται για να απομακρυνθούν τα ερυθρά.

4. Τα δείγματα είναι ευαίσθητα στο φως, γι’ αυτό καλύπτονται με αλουμινόχαρτο και καταψύχονται άμεσα (-20^οC έως -80 ^οC) μέχρι την αποστολή στο εργαστήριο.

• Ελάχιστη απαιτούμενη ποσότητα δείγματος: 1ml ENY
• Συνθήκες μεταφοράς : σε ξηρό πάγο ή με παγοκύστες

Για την ανάλυση των Πτερινών στα ούρα απαιτούνται τουλάχιστον 5 ml ούρα, τα οποία καταψύχονται άμεσα αφού καλυφθούν με αλουμινόχαρτο. 

Διαχείριση αποτελεσμάτων

• Χρόνος αναφοράς αποτελεσμάτων : 15 ημέρες από την λήψη του δείγματος.
• Χρόνος συντήρησης των δειγμάτων στο εργαστήριο: 2 μήνες. 

Τιμές αναφοράς: Οι τιμές των ΒΑ και των πτερινών εξαρτώνται από την ηλικία. Οι φυσιολογικές τιμές των ΒΑ είναι μεγαλύτερες στα παιδιά έως 3 μηνών και σταδιακά ελαττώνονται καθώς αυξάνεται η ηλικία, ώσπου σταθεροποιούνται κάπως μετά την ηλικία περίπου των πέντε χρόνων.  

Ποιοτικός έλεγχος

•  Το εργαστήριο εφαρμόζει εσωτερικό ποιοτικό έλεγχο αναλύοντας καθημερινά δείγματα-control (φυσιολογικά και επιφορτισμένα παθολογικά).
•  Εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος πραγματοποιείται με συμμετοχή του εργαστηρίου στα Διεργαστηριακά Προγράμματα Ποιοτικού Ελέγχου, του European Research Network for Diagnosis and Treatment of Inherited disorders of Metabolism (ERNDIM). Αναλύονται ποσοτικά και γίνεται διάγνωση σε 8 άγνωστα δείγματα κάθε χρόνο (φυσιολογικά και παθολογικά).

Επεξήγηση αποτελεσμάτων –Αναφορά

Για την ορθή αξιολόγηση των αποτελεσμάτων είναΙ απαραίτητη η συμπλήρωση ιστορικού το οποίο περιλαμβάνει: Συμπτώματα, φαρμακευτική αγωγή. Η ορθή λήψη του δείγματος είναι απαραίτητη για την ορθή εξαγωγή συμπερασμάτων. Κάποια φάρμακα μπορεί να επηρεάσουν τις τιμές των ΒΑ στο ΕΝΥ. Συνιστάται αποχή από την φαρμακευτική αγωγή για τουλάχιστον 1-4 εβδομάδες πριν την ΟΣΝ.

Σε περίπτωση παθολογικού αποτελέσματος, δίνεται αναφορά με λεπτομερή επεξήγηση των αποτελεσμάτων, στοιχεία διαφορικής διάγνωσης και περαιτέρω συμπληρωματικές διαγνωστικές εξετάσεις. 

Εικόνα 1. Χρωματογράφημα HPLC με ηλεκτροχημικό ανιχνευτή των βιογενών αμινών (homovanillic–HVA, 5-hydroxy–indoloacetic-5HIAA, 3-o–methyldopa-3OMD, 5-hydroxytryptophan-5OHTrp) σε δείγματα ΕΝΥ από α) φυσιολογικό ασθενή, β) ασθενή με AADC, γ) ασθενή με Dopamine Transporter Defect σε δείγματα διεργαστηριακού ποιοτικού ελέγχου ERNDIM.

Εικόνα 2. Χρωματογράφημα HPLC με φθορισμομετρικό ανιχνευτή των πτερινών (neopterin, biopterin) σε δείγμα ούρων.

Βιβλιογραφία

1. Ormazabal A., et al., 2005. HPLC with electrochemical and fluorescence detection procedures for the diagnosis of inborn errors of biogenic amines and pterins, J. Neuroscience Methods, 142, 153-158.
2. Kurian M.A. et al., 2011. The monoamine neurotransmitter disorders: an expanding range of neurological syndromes, Lancet Neurology, 10, 721-733.
3. Burlina A.B., et al., 2017. The utility of CSF for the diagnosis of primary and secondary monoamine neurotransmitter deficiencies, eJIFCO, 28, 064-076.