Οργανικά Οξέα

Σκοπός
Τα οργανικά οξέα αποτελούν ενδιάμεσους μεταβολίτες όλων των οργανικών κυτταρικών συστατικών: αμινοξέων, λιπιδίων υδατανθράκων στεροιδών και νουκλεϊκών οξέων. Οι οργανικές οξυουρίες χαρακτηρίζονται από συγκέντρωση στα ούρα μεταβολιτών που δεν εκκρίνονται σε φυσιολογικές καταστάσεις, είτε απέκκριση μεταβολιτών σε παθολογικές συγκεντρώσεις ως αποτέλεσμα της ενεργοποίησης εναλλακτικών οδών του μεταβολισμού εξαιτίας της μειωμένης ή μη ενεργότητας κάποιου ενζύμου. Ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των οργανικών οξέων ούρων εξυπηρετεί τη διερεύνηση των ενδογενών διαταραχών του μεταβολισμού.
Ενδείξεις Ελέγχου
- Επιβεβαίωση παθολογικών ευρημάτων στο νεογνικό Προληπτικό Έλεγχο (Newborn Screening).
- Σοβαρή μεταβολική αποδιοργάνωση στη νεογνική ηλικία (ταχύπνοια, έμετοι, κέτωση, υπεραμμωνιαιμία, υπογλυκαιμία, μεταβολική οξέωση) ή υποτροπιάζοντα επεισόδια μεταβολικής αποδιοργάνωσης.
- Συμπτώματα από το ΚΝΣ (σπασμοί, υποτονία, λήθαργος, αναπτυξιακή καθυστέρηση).
- Ιδιαίτερα Κλινικά ευρήματα (μακροκεφαλία, δυσμορφίες).
- Ανεπαρκής πρόσληψη βάρους.
Αρχή της μεθόδου
Αεριοχρωματογραφία – Φασματομετρία Μαζών (GC- MS Electron Impact)
Ποσότητα ούρων 0.5 – 3 mL, αντιστοιχόυσα σε 5 mg κρεατινίνης κατεργάζεται με αλκαλικό διάλυμα υδροχλωρικής υδροξυλαμίνης για τη μετατροπή των α- κετο- οξέων στις αντίστοιχες οξίμες και στη συνέχεια οξινίζεται και παραλαμβάνονται τα οργανικά οξέα σε οξεικό αιθυλεστέρα. Μετά τη συμπύκνωση τα οργανικά οξέα μετατρέπονται σε πτητικά σιλιλιωμένα παράγωγα με παραγωγοποίηση στους 60 οC για 30 min, με τη βοήθεια σιλιλιωτικού μέσου BSTFA + 1% TMCS και το διάλυμα εισάγεται στον αεριοχρωματογράφο – φασματόμετρο μαζών ηλεκτρονιακού ιονισμού (GC MSD, EI scan mode), για ανάλυση.
Τα οργανικά οξέα ταυτοποιούνται με βάση τον χρόνο έκλουσής τους από την αεριοχρωματογραφική στήλη διαχωρισμού και το φάσμα μαζών τους, με χρήση 2 βιβλιοθηκών φασμάτων μάζας και καταλλήλου λογισμικού επεξεργασίας των φασμάτων μάζας (Deconvolution Software).Ο ποσοτικός προσδιορισμός των μεταβολιτών επιτυγχάνεται με τη χρήση 2 εσωτερικών προτύπων και γραμμικών καμπυλών αναφοράς για όλους τους μεταβολίτες. Ως όριο ποσοτικού προσδιορισμού έχει προσδιορισθεί συγκέντρωση < 1 mmol/mol κρεατινίνης ούρων για όλες τις ουσίες (Η κρεατινίνη μετράται με φασματομετρική κινητική μέθοδο Jaffe).Τα αποτελέσματα μετατρέπονται σε mmol/mol κρεατινίνης ούρων και για την αξιολόγησή τους συγκρίνονται με τιμές αναφοράς μιας σειράς ηλικιακών ομάδων, από 1 ημέρας – μεγαλύτερος από 18 ετών. Εάν το αποτέλεσμα του προσδιορισμού υποδείξει την παρουσία ακυλογλυκινών, γίνεται επιπλέον ποσοτικός προσδιορισμός ακυλογλυκινών με αέριο χρωματογραφία – φασματομετρία μαζών σε λειτουργία Επιλεκτικής Ανίχνευσης Ιόντων και τεχνική σταθερών ισοτόπων, μετά από μετατροπή τους σε βουτυλεστέρες ,προκειμένου να επιτευχθεί μεγαλύτερη ακρίβεια και ευαισθησία κατά τον ποσοτικό τους προσδιορισμό.
Προετοιμασία του ασθενούς-Δειγματοληψία
5 mL ούρα (κατ’ ελάχιστο) από μια τυχαία συλλογή, σε πλαστικό φιαλίδιο. Το δείγμα μετά τη λήψη φυλάσσεται στην κατάψυξη (-20 oC) και μεταφέρεται στο εργαστήριο κατεψυγμένο.
- Ελάχιστη απαιτούμενη ποσότης δείγματος: 5 ml.
- Συνθήκες μεταφοράς: σε ξηρό πάγο ή με παγοκύστες.
Διαχείριση αποτελεσμάτων
Πραγματοποίηση ανάλυσης: Δευτέρα – Τετάρτη – Παρασκευή.
Καθημερινά για δείγματα με το χαρακτηρισμό ΕΠΕΙΓΟΝ.
Χρόνος αναφοράς αποτελεσμάτων : 4 εργάσιμες ημέρες ή 1 ημέρα για δείγματα με το χαρακτηρισμό ΕΠΕΙΓΟΝ (από την ημέρα παραλαβής του δείγματος μέχρι την έκδοση και αποστολή της αναφοράς αποτελεσμάτων).
Χρόνος συντήρησης των δειγμάτων στο εργαστήριο: Τα δείγματα φυλάσσονται στους -80 C, μετά από την ανάλυση για χρονικό διάστημα 3 μηνών, μετά την πάροδο του οποίου καταστρέφονται διαχειριζόμενα ως νοσοκομειακά απόβλητα.
Ποιοτικός έλεγχος
- Συμμετοχή στο διαεργαστηριακό σχήμα του European Research Network for Diagnosis and treatment of Inhereted disorders of Metabolism (ERNDIM): “Organic Acids Quantitative” ποσοτικού προσδιορισμού μιας σειράς οργανικών οξέων (8 τεχνητά επιφορτισμένα δείγματα ούρων/έτος , με στόχο τον ποσοτικό προσδιορισμό των μεταβολιτών και τον υπολογισμό της ακρίβειας και της γραμμικότητας της μεθόδου).
- Συμμετοχή στο διαεργαστηριακό σχήμα ERNDIM : “Organic Acids Qualitative, Heidelberg” (9 δείγματα ούρων υπόπτων ασθενών/έτος, από τα οποία μέσω της εξέτασης Οργανικών Οξέων Ούρων, επιτυγχάνεται διερεύνηση ενδογενών μεταβολικών διαταραχών).
Επεξήγηση αποτελεσμάτων- Αναφορά
Για την ορθή αξιολόγηση των αποτελεσμάτων είναι απαραίτητη η συμπλήρωση Ιστορικού, το οποίο πρέπει να περιλαμβάνει:
- Ηλικία του ασθενούς.
- Σε περίπτωση νεογνού, το βάρος γεννήσεως και την ηλικία κυήσεως.
- Άλλες Κλινικές πληροφορίες (συμπτώματα, πιθανή υποψία νοσήματος).
- Φαρμακευτική αγωγή.
Τα αποτελέσματα του ποσοτικού προσδιορισμού των οργανικών οξέων ούρων, συνεκτιμώνται συνήθως με άλλες εργαστηριακές αναλύσεις Μεταβολικού ελέγχου.
Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων βασίζεται περισσότερο στην ανάλυση ενός προφίλ (pattern recognition) παρά σε μεμονωμένες τιμές Μεταβολιτών.
Σε όποιες περιπτώσεις αιματουρία, λιπιδαιμία, χολερυθριναιμία ή άλλο συντελούν σε αμφίβολο αποτέλεσμα λόγω φύσης του δείγματος η εξέταση επαναλαμβάνεται σε νέο δείγμα.
Η εξέταση επίσης επαναλαμβάνεται αν μετά από χρήση φαρμάκων, ειδικού γάλακτος ή διατροφής κριθεί απαραίτητο για την αξιολόγηση του αποτελέσματος.
Δίνεται αναφορά με λεπτομερή επεξήγηση των αποτελεσμάτων και της σημασίας τους, στοιχεία διαφορικής διάγνωσης και προτάσεις για περαιτέρω συμπληρωματικές διαγνωστικές εξετάσεις.
Βιβλιογραφία
- “GC- MS profiling of urinary organic acids evaluated as a quantitative method” Pierre Duez, Alain Kumps and Yves Mardens. Clinical Chemistry 42:10 1609-1615 (1996).
- “Organic Acids” Piero Rinaldo, Laboratory Guide to the Methods in Biochemical Genetics, Edt. N. Blau, M. Duran, M. Gibson , Springer – Verlang 2008.
