Κετόνες

Σκοπός

Οι κετόνες αποτελούν ενδιάμεσους μεταβολίτες που παίζουν σημαντικό ρόλο την παραγωγή ενέργειας. Στο αίμα προσδιορίζονται οι κετόνες 3-υδρόξυ-βουτυρικό (3-hydroxy-butyric) και ακετοξικό (acetoacetic) οξύ με ταυτόχρονο προσδιορισμό του γαλακτικού και του πυροσταφυλικού οξέος: ο προσδιορισμός και των τεσσάρων μεταβολιτών είναι δείκτης της διατροφικής ισορροπίας, ενώ η αύξηση των επιπέδων τους αποτελεί συχνή αιτία μεταβολικής οξέωσης στα παιδιά. Ο προσδιορισμός τους είναι χρήσιμος στην πρώιμη ανίχνευση, διάγνωση και στην θεραπευτική παρακολούθηση των εξής διαταραχών:

• Ενζύμων του μεταβολισμού του πυροσταφυλικού οξέος (Pyruvate Dehydrogenase (PDH), Pyruvate Carboxylase (PC).
• Ενζύμων του κύκλου του Krebs
• Ενζύμων της γλυκονεογένεσης (gluconeogenesis)
• Ηπατικής γλυκογενόλυσης
• Οξείδωσης των Λιπαρών οξέων
• Κετογένεσης, Κετόλυσης
• Αναπνευστικής αλύσου

Στα ούρα (από την ανάλυση των Οργανικών οξέων) προσδιορίζονται οι κετόνες 3-hydroxy-butyric, acetoacetic και 2-ketobutyric, το γαλακτικό, πυροσταφυλικό οξύ και μια σειρά μεταβολιτών που αυξάνονται/επηρεάζονται σε καταστάσεις κέτωσης: 2-hydroxy-butyric, 3-hydroxy-isobutyric, δικαρβοξυλικά οξέα, γλυκίνες.

Κατά την νηστεία, οι ορμονικές ή μεταβολικές διαδικασίες χρησιμοποιούν την ενέργεια που αποθηκεύεται ως λίπος στους λιπώδεις ιστούς. Η μέτρηση των μεταβολιτών αυτών σε συνδυασμό με τον προσδιορισμό των Ελεύθερων Λιπαρών οξέων (FFA) και της γλυκόζης σε διαφορετικές ώρες και περιόδους νηστείας μέσα στην ημέρα (προ και μετά γεύματος) δίνουν πολύτιμες πληροφορίες για τις διαφορετικές φάσεις του μεταβολισμού των λιπιδίων.

Ο προσδιορισμός του γαλακτικού οξέος (CH3-CHOH-COOH) στο αίμα δείχνει την ισορροπία ανάμεσα στην παραγωγή και την κατανάλωση του. Είναι το τελικό προϊόν της αναερόβιας γλυκόλυσης, η οποία αποτελεί την βασική πηγή ενέργειας για ιστούς όπως η καρδιά, οι μύες, τα νεφρά. Επίπεδα γαλακτικού οξέος μεγαλύτερα από 7 mmol/L οδηγούν σε γαλακτική οξέωση και μπορεί να υπάρχουν σε μεταβολικές νόσους (PDH, PC) ή σε ισχαιμικές καταστάσεις. Κατά την νηστεία το γαλακτικό χρησιμοποιείται από το συκώτι  και τα νεφρά για την παραγωγή γλυκόζης (γλυκονεογένεση). Τα επίπεδα γαλακτικού οξέος ελαττώνονται κατά τις πρώτες 15 ώρες της νηστείας (περίπου κατά 30%, ανεξαρτήτως ηλικίας). Μετά το γεύμα το γαλακτικό οξύ οξειδώνεται στα μιτοχόνδρια παράγοντας  ενέργεια για την καρδιά, τους μύες και τα νεφρά. Ο λόγος γαλακτικό/πυροσταφυλικό οξύ είναι διαγνωστικός και παραμένει σταθερός ανεξαρτήτως από την φάση νηστείας.

Το γαλακτικό και το πυροσταφυλικό οξύ αλληλομετατρέπονται μέσα στο κυτταρόπλασμα, ανάλογα με την αναλογία NAD:NADH. Στο κυτταρόπλασμα, η αναλογία γαλακτικού προς πυροσταφυλικό αντανακλά την κατάσταση οξειδοαναγωγής.

Το πυροσταφυλικό οξύ (CH3-CO-COOH) είναι ένας ενδιάμεσος μεταβολίτης: το προϊόν του μεταβολισμού των υδατανθράκων, του λίπους ή της πρωτεΐνης. Το πυροσταφυλικό είναι το τελικό στάδιο της γλυκόλυσης. Στα μιτοχόνδρια, το πυροσταφυλικό μπορεί να οξειδωθεί σε CO2 και H2O, να αναχθεί σε ακετυλοσυνένζυμο Α (ακετυλο CoA) από το ένζυμο PDH, ή να καρβοξυλιωθεί από το ένζυμο PC σε οξαλοξικό οξύ. Το πυροσταφυλικό μετατρέπεται σε γαλακτικό από την γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) υπό αναερόβιες συνθήκες.

Τα κετονικά σώματα (KBs) κυκλοφορούν στο αίμα ως 3-υδρόξυ-βουτυρικό (CH3-CHOH-CH2-COOH) και ακετοξικό ACAC (CH3-CO-CH2-COOH). Οι συγκεντρώσεις αυτών των δύο μεταβολιτών στο αίμα εξαρτώνται από την ισορροπία μεταξύ της παραγωγής τους από το ήπαρ (κετογένεση) και την κατανάλωση σε περιφερικό επίπεδο (κετογενόλυση). Ανωμαλίες του μεταβολισμού των κετονών εκδηλώνεται ως κέτωση, μη κετωτική υπογλυκαιμία και αναστροφή του λόγου 3-υδρόξυ-βουτυρικό:αραχιδονικό οξύ (AA).

Στην κατάσταση μετά γεύματος, οι συγκεντρώσεις του 3-υδρόξυ-βουτυρικού οξέος δεν υπερβαίνουν συνήθως τα 0.2 mmol/l, εκτός από τη νεογνική περίοδο, όπου παρατηρούνται υψηλότερες συγκεντρώσεις. Τα επίπεδα του ACAC αυξάνονται πιο γρήγορα από αυτά του 3-υδρόξυβουτυρικού. Η συγκέντρωση των KBs στο αίμα αυξάνεται κατά τη νηστεία, με σχετική αύξηση του λόγου 3OHB:ACAC, που είναι το αποτέλεσμα της αναστολής του ενζύμου PDH από το μιτοχονδριακό ακετυλο-CoA και το NADH. Τα KBs συντίθενται κυρίως στο ήπαρ από το ακέτυλο CoA, το προϊόν της οξείδωσης του λιπαρού οξέος.

Η αλληλομετατροπή μεταξύ ACAC και 3OHB εξαρτάται από την αναλογία NAD:NADH. Η υδροξυβουτυρική αφυδρογονάση (HBDH) εντοπίζεται κυρίως στα μιτοχόνδρια. Κατά τη διάρκεια νηστείας, τα λιπαρά οξέα μεταφέρονται στο ήπαρ για να υποβληθούν σε β-οξείδωση. Το Ακύλο συνένζυμο Αs εισάγονται στα μιτοχόνδρια μετά την εστεροποίηση του συνενζύμου Α στο κυτταρόπλασμα. Η είσοδος στο μιτοχόνδριο εξαρτάται από μια μεταφορά διπλής μεμβράνης που περιλαμβάνει τις ακυλοτρανσφεράσες καρνιτίνης II και I. Η περίσσεια του ακέτυλο CoA χρησιμοποιείται για τη σύνθεση KB. Τα KBs μεταφέρονται στο αίμα και τελικά μεταβολίζονται μέσω του κύκλου του Krebs. Τα KB είναι απαραίτητα για την παροχή ενέργειας στον εγκέφαλο κατά τη διάρκεια της νηστείας, ένα πραγματικό εναλλακτικό υπόστρωμα αντί της γλυκόζης.

Αρχή της μεθόδου

Ο προσδιορισμός των κετονών στο αίμα και στα ούρα γίνεται με Αέρια Χρωματογραφία/ Φασματομετρία Μάζας (GC–MS), με προετοιμασία αντίστοιχη των Οργανικών οξέων στα ούρα: η προετοιμασία περιλαμβάνει κατεργασία με αλκαλικό διάλυμα υδροχλωρικής υδροξυλαμίνης για την μετατροπή των α- κετο-οξέων πυροσταφυλικό και ακετοξεικό στις αντίστοιχες οξίμες. Ακολουθεί οξίνιση, εκχύλιση με οξεικό αιθυλεστέρα, ξήρανση και παραγωγοποίηση τους με BSTFA + 1% TMCS. 

Δειγματοληψία

• ΟΥΡΑ: 10 mL ούρα από τα πρώτα πρωϊνά, μια τυχαία συλλογή ή σε φάση κρίσης σε πλαστικό φιαλίδιο ή ουροσυλλέκτη. Το δείγμα μετά τη λήψη φυλάσσεται στην κατάψυξη (-20^oC) και μεταφέρεται στο εργαστήριο  κατεψυγμένο.

• ΑΙΜΑ: οι συνθήκες λήψης είναι οι ίδιες με τις συνθήκες λήψης γαλακτικού/πυροσταφυλικού οξέος στο αίμα. Χρειάζονται τα ειδικά φιαλίδια από το εργαστήριο τα οποία περιέχουν 1 ml Υπερχλωρικού οξέος 1Μ για να γίνει η αποπρωτεΐνωση των δειγμάτων και να αποφευχθεί η γλυκόλυση, καθώς το πυροσταφυλικό και το ACAC είναι ασταθή. Η ανάμιξη θα πρέπει να γίνει εντός 5 min από την δειγματοληψία.

1. Φλεβοπαρακέντηση και λήψη ολικού αίματος σε ηπαρηνισμένη σύριγγα. Η λήψη πρέπει να γίνει χωρίς περίδεση.
2. Μεταφορά μισού mL (0,5 mL) ολικού αίματος στο φιαλίδιο με το ειδικό αντιδραστήριο (1 ml Υπερχλωρικού οξέος 1Μ) για την καταβύθιση των πρωτεϊνών του αίματος.
3. Ανακίνηση: Μετά τη μεταφορά του αίματος στο φιαλίδιο θα παρατηρηθούν καφέ – γκρι κροκίδες.
4. Φυγοκέντρηση στις 6000rpm για 10 λεπτά (εάν είναι δυνατή) και λήψη του υπερκειμένου.
5. Φύλαξη στους -20^οC μέχρι την αποστολή στο εργαστήριο (έως 5 ημέρες).
6. Αποστολή σε παγοκύστεις ή πάγο.

Τα φιαλίδια περιέχουν ειδικό διάλυμα αποπρωτεϊνισμού και η ποσότητα του ολικού αίματος που θα μεταφερθεί σε αυτά θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πιο ακριβής. Η ποσότητα του ειδικού αντιδραστηρίου που περιέχεται στα φιαλίδια αντιστοιχεί σε 0,5 mL ολικού αίματος ( ανά φιαλίδιο).  Το ίδιο φιαλίδιο είναι κατάλληλο και επαρκές και για τις τρεις αναλύσεις (γαλακτικό, πυροσταφυλικό οξύ, κετόνες). Αυξημένη τιμή του λόγου γαλακτικό:πυροσταφυλικό οξύ μπορεί να προκύψει όταν μεταξύ της δειγματοληψίας και του αποπρωτεϊνισμού περάσουν πάνω από 5 λεπτά.   

• Ελάχιστη απαιτούμενη ποσότητα δείγματος: 500 μL ολικό αίμα ή 5 ml ούρα
• Συνθήκες μεταφοράς : σε ξηρό πάγο ή με παγοκύστες
• Συνθήκες αποθήκευσης: έως 5 ημέρες στους -20^οC

Διαχείριση αποτελεσμάτων

• Χρόνος αναφοράς αποτελεσμάτων: 10 ημέρες από την λήψη του δείγματος.
• Χρόνος συντήρησης των δειγμάτων στο εργαστήριο: 2 μήνες. 

Τιμές αναφοράς 

ΑΙΜΑ: Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται οι φυσιολογικές τιμές των κετονών, του γαλακτικού και του πυροσταφυλικού οξέος στο πλάσμα, οι οποίες διαφοροποιούνται ανάλογα με την φάση νηστείας: οι τιμές των κετονών και του λόγου 3OHB: ACAC αυξάνονται σε περιόδους νηστείας και είναι χαμηλές μετά από σίτιση. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε mmol/L πλάσματος.

• ΟΥΡΑ: Στον παρακάτω πίνακα συνοψίζονται οι φυσιολογικές τιμές των κετονών στα ούρα, όπως αναλύονται με την μέθοδο των Οργανικών Οξέων στα ούρα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε mmol/mol κρεατινίνης.

Ποιοτικός έλεγχος

•  Το εργαστήριο εφαρμόζει εσωτερικό ποιοτικό έλεγχο αναλύοντας καθημερινά δείγματα-control (φυσιολογικά και επιφορτισμένα παθολογικά).
• Εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος πραγματοποιείται με συμμετοχή του εργαστηρίου στα Διεργαστηριακά Προγράμματα Ποιοτικού Ελέγχου, του European Research Network for Diagnosis and Treatment of Inherited disorders of Metabolism (ERNDIM) για το 3-hydroxybutyric acid: 1. αναλύονται κάθε χρόνο 8  δείγματα (Special Assays in Serum Scheme (SAS), Organic Acids scheme (OA)) αγνώστου συγκέντρωσηςμε τιμές από φυσιολογικές έως παθολογικές, 2. ERNDIM OA CONTROL, Level 1-2 .

Επεξήγηση αποτελεσμάτων –Αναφορά 

Για την ορθή αξιολόγηση των αποτελεσμάτων είναι απαραίτητη η συμπλήρωση ιστορικού το οποίο περιλαμβάνει: Συμπτώματα, φαρμακευτική αγωγή. Η ορθή λήψη και προετοιμασία του δείγματος είναι απαραίτητη για την ορθή εξαγωγή συμπερασμάτων. Σε περίπτωση παθολογικού αποτελέσματος, δίνονται στοιχεία διαφορικής διάγνωσης και περαιτέρω συμπληρωματικές διαγνωστικές εξετάσεις.  

Οι βασικές αιτίες του αυξημένου γαλακτικού οξέος (κληρονομικού, επίκτητου) συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα.

Βιβλιογραφία

1. Vassault A : Lactate, Pyruvate, Acetoacetate and 3-Hydroxybutyrate. In Laboratory Guide to the Methods in Biochemical Genetics. Edited by N. Blau, M. Duran, M. Gibson.  Springer-Verlag , Berlin. 2008 pp 35-51.
2. Paik M.J., Cho EY., Kim H., Kim K.R., Choi S., Ahn Y.H., Lee, G., 2008. Simultaneous clinical monitoring of lactic acid, pyruvic acid and ketone bodies in plasma as methoxime/tert-butyldimethylsilyl derivatives by gas chromatography-mass spectrometry in selected ion monitoring mode, Biomedical Chromatography, 22, 450-453.