Λιπαρά Οξέα Μακράς Αλύσου / Φυτανικό Πριστανικό

Σκοπός

Μια από τις βασικές λειτουργίες των υπεροξυσωμάτων (peroxisomes) είναι η β-οξείδωση των λιπαρών οξέων μακράς αλύσου (C22-C26) και η α-οξείδωση των λιπαρών διακλαδισμένης αλύσου  (φυτανικό, πριστανικό). Ο προσδιορισμός τους αποτελεί δείκτη για την διάγνωση υπεροξοσωμιακών διαταραχών (peroxisomal disorders):

• Διαταραχές της βιογένεσης των υπεροξυσωμάτων (peroxisome biogenesis disorders): σύνδρομο Zellweger, Infantile Refsum Disease, Neonatal Adrenoleukodystrophy, Rhizomelic chondrodysplasia punctata.
• Μεμονωμένες ελλείψεις υπεροξοσωμιακών ενζύμων (single peroxisomal enzyme deficiencies): X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD), D-Bisfunctional Protein deficiency, 2-methyl-acyl-CoA racemace deficiency, Refsum Disease.

Οι υπεροξωσωμιακές διαταραχές περιλαμβάνουν τα ακόλουθα κλινικά χαρακτηριστικά:

• Δυσμορφικά χαρακτηριστικά
• Σκελετικές ανωμαλίες
• Νευρολογικές διαταραχές (εγκεφαλοπάθεια, υποτονία, σπασμοί, κώφωση)
• Οφθαλμολογικές  διαταραχές (ρετινοπάθεια, καταράκτης, τύφλωση)
• Ηπατική δυσλειτουργία (ηπατίτιδα, ηπατομεγαλία, χολόσταση, κίρρωση)

Αρχή της μεθόδου

Ο προσδιορισμός των λιπαρών οξέων μακράς αλύσου-φυτανικού-πριστανικού γίνεται στο πλάσμα (στα ούρα δεν εκκρίνονται) με Αέρια Χρωματογραφία/ Φασματομετρία Μάζας (GC-MS). Προηγείται όξινη και αλκαλική υδρόλυση του δείγματος (πλάσμα), ακολουθούμενη απο εκχύλιση με εξάνιο, ξήρανση και παραγωγοποίηση τους με MTBSTFA. 

Δειγματοληψία

Η δειγματοληψία γίνεται κατά προτίμηση μετά από (4 ωρών) νηστεία. Με εξαίρεση το φυτανικό οξύ, το οποίο έχει αποκλειστικά διατροφική προέλευση, τα υπόλοιπα οξέα δεν επηρεάζονται σημαντικά από την νηστεία, την διατροφή ή την άσκηση. Επομένως μπορεί να χρησιμοποιηθεί και δείγμα ανευ νηστείας.

1. Φλεβοπαρακέντηση και λήψη περίπου 2 ml ολικού αίματος.

2. Μεταφορά σε φιαλίδιο γενικής αίματος (με EDTA ως αντιπηκτικό^*).

3. Φυγοκέντρηση για 10 min στις 6000 rpm και λήψη υπερκειμένου (πλάσματος).

4. Αποθήκευση δείγματος σε κατάψυξη (-20^οC) μέχρι την αποστολή στο εργαστήριο.

5. Aποστολή στο εργαστήριο με παγοκύστες ή πάγο.   

* δείγμα που ελήφθη σε ηπαρινισμένη σύριγγγα δίνει τα ίδια αποτελέσματα.

• Ελάχιστη απαιτούμενη ποσότητα δείγματος: 500 μL ολικό αίμα ή 200 μL πλάσμα
• Συνθήκες μεταφοράς : σε ξηρό πάγο ή με παγοκύστες

Διαχείριση αποτελεσμάτων

• Ανάλυση: Δευτέρα έως Παρασκευή.
• Χρόνος αναφοράς αποτελεσμάτων : 2 ημέρες από την λήψη του δείγματος.
• Χρόνος συντήρησης των δειγμάτων στο εργαστήριο: 2 μήνες. 

Τιμές αναφοράς

Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται οι φυσιολογικές τιμές των VLCFA-φυτανικού-πριστανικού. Οι τιμές των VLCFA είναι ανεξάρτητες από την ηλικία. Η τιμή του φυτανικού και του πριστανικού οξέος επηρεάζονται από την διατροφή. 

Διαγνωστικοί είναι και οι λόγοι: C24/C22 και C26/C22. Σε περίπτωση παθολογικού αποτελέσματος για την διαφορική διάγνωση σημαντικός είναι επιπλέον ο προσδιορισμός πιπεκολικού οξέος στο πλάσμα και των πλασμαλογόνων στα ερυθροκύτταρα. Για την διάγνωση ενός παθολογικού αποτελέσματος πρέπει να ακολουθήσει περαιτέρω έλεγχος στους ινοβλάστες (ένζυμα) και μοριακός έλεγχος (mutation screening).  

Ποιοτικός έλεγχος

• Το εργαστήριο εφαρμόζει εσωτερικό ποιοτικό έλεγχο αναλύοντας δείγματα που προέρχονται από ανεξάρτητο κατασκευαστή.
• Εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος πραγματοποιείται με συμμετοχή του εργαστηρίου στα Διεργαστηριακά Προγράμματα Ποιοτικού Ελέγχου, του European Research Network for diagnosis and treatment of Inherited disorders of Metabolism (ERNDIM).
• Special Assays in Serum

Αναλύονται 8 δείγματα κάθε χρόνο με τιμές από φυσιολογικές έως παθολογικές.

Επεξήγηση αποτελεμάτων –Αναφορά

Για την ορθή αξιολόγηση των αποτελεσμάτων είναΙ απαραίτητη η συμπλήρωση ιστορικού το οποίο περιλαμβάνει: Συμπτώματα, φαρμακευτική αγωγή, λήψη δείγματος πριν ή μετά από γεύμα. Η ορθή λήψη και προετοιμασία του δείγματος είναι απαραίτητη για την ορθή εξαγωγή συμπερασμάτων. 

Σε περίπτωση παθολογικού αποτελέσματος, δίνεται αναφορά με  λεπτομερή επεξήγηση των αποτελεσμάτων, στοιχεία διαφορικής διάγνωσης και περαιτέρω συμπληρωματικές διαγνωστικές εξετάσεις. 

Βιβλιογραφία

1. R.J.A. Wanders, M. Duran. Very-Long-Chain Fatty Acids and Phytanic acid. In Laboratory Guide to the Methods in Biochemical Genetics. Edited by N. Blau, M. Duran, K.M. Gibson. Springer-Verlag, Berlin. 2008, pp 221-231.
2. S. Steinberg, R. Jones, C. Tiffany, A. Moser. Investigational methods for peroxisomal disorders, Current Protocols in Human Genetics, 2008, 17.6.1-17.6.23.