Ομοκυστεΐνη Μεθυλμαλονικό

Σκοπός

Το Μεθυλμαλονικό οξύ (Methylmalonic acid, MMA) και η ολική Oμοκυστεΐνη (total Homocysteine, tHCYS) στο πλάσμα χρησιμοποιούνται σαν δείκτες των επιπέδων της κοβαλαμίνης (βιταμίνη Β12) και αυξάνονται σε ασθενείς με ανεπάρκεια της Β12. Αυξημένα επίπεδα του μεθυλμαλονικού οξέος στο πλάσμα και /ή στα ούρα σε νεογνά που θηλάζουν από vegan ή με σοβαρή αναιμία μητέρες μπορεί να υποδηλώνει ανεπάρκεια βιταμίνης Β12. Η ολική ομοκυστεΐνη είναι λιγότερο εξειδικευμένος δείκτης της ανεπάρκειας της Β12 σε σχέση με το μεθυλμαλονικό οξύ και η συγκέντρωση της ολικής ομοκυστεΐνης επηρεάζεται και από διατροφικές συνήθειες, γενετικούς παράγοντες και κάποιες ασθένειες. Η ολική ομοκυστεΐνη είναι αξιόπιστος δείκτης και αυξάνεται στην περίπτωση της ανεπάρκειας του φυλλικού οξέος. Αυξημένη τιμή της ομοκυστεΐνης μπορεί να βρεθεί και στην περίπτωση ανεπάρκειας της βιταμίνης Β6.

Μεθυλμαλονικό Οξύ

Εξειδικευμένα τεστ για την αξιολόγηση της Β12 αποτελούν η μέτρηση του μεθυλμαλονικού οξέος στο αίμα και στα ούρα. Τα επίπεδα του μεθυλμαλονικού οξέος στα ούρα είναι δείκτης της  λειτουργικής επάρκειας της Β12, ενώ στο αίμα είναι δείκτης της ποσότητας της Β12 που είναι διαθέσιμη προς χρήση.  Η διάκριση αυτή είναι σημαντική γιατί υπάρχει η πιθανότητα μια φαινομενικά ‘φυσιολογική’ τιμή μεθυλμαλονικού οξέος στο αίμα να είναι ουσιαστικά ανεπαρκής για τα ένζυμα της Β12 προκειμένου να επιτελέσουν βασικές μεταβολικές λειτουργίες. Για αυτό και η μέτρηση του μεθυλμαλονικού οξέος στο αίμα και στα ούρα αποκαλείται η ‘gold standard’ μέθοδο για τη εκτίμηση των επιπέδων της Β12 στους ιστούς.

Ομοκυστεΐνη

Η ομοκυστεΐνη σχηματίζεται από το βασικό αμινοξύ μεθειονίνη και ο μεταβολισμός της εξαρτάται από τις βιταμίνες του συμπλέγματος Β: φυλλικό οξύ, κοβαλαμίνη, πυριδοξίνη, ριβοφλαβίνη, χολίνη, βεταίνη. Υψηλά επίπεδα ομοκυστείνης έχουν συσχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο καρδιαγγειακών νοσημάτων, οστεοπόρωση και επιπλοκές στην εγκυμοσύνη. Στην φυσιολογική εγκυμοσύνη τα επίπεδα της ποικίλλουν, είναι μικρότερα σε σχέση με τις μη έγκυες και μάλιστα έχουν την τάση να ελαττώνονται κατά το 2^ο και 3^ο τρίμηνο. Αυξημένα επίπεδα ομοκυστεΐνης κατά την εγκυμοσύνη έχουν σχετιστεί με προβλήματα, όπως προεκλαμψία, πρόωρες αποβολές, αποκόλληση του πλακούντα, φλεβική θρόμβωση και καθυστέρηση στην ενδομήτρια ανάπτυξη. Η ομοκυστεΐνη μαζί με το μεθυλμαλονικό οξύ αποτελούν δείκτες για την αξιολόγηση πιθανόν διαταραχών του μεταβολισμού της βιταμίνης Β12. Ανεπάρκεια της βιταμίνης Β12 μπορεί να προκληθεί από ανεπαρκή διατροφική πρόσληψη, μη φυσιολογική απορρόφηση ή αυξημένες απαιτήσεις όπως συμβαίνει στην εγκυμοσύνη.

Αρχή της μεθόδου

Ο προσδιορισμός του Μεθυλμαλονικού οξέος και της ολικής Oμοκυστεΐνης στο πλάσμα γίνεται ταυτόχρονα και για τις δυο ουσίες με Αέρια Χρωματογραφία/ Φασματομετρία Μάζας (GC-MS). Η προετοιμασία περιλαμβάνει επώαση των δειγμάτων με dithioerythritol για να αναχθούν οι δισουλφιδικοί δεσμοί της Ομοκυστεΐνης, αποπρωτεΐνισμό, παραγωγοποίηση των μεταβολιτών με methylchloroformate και εκχύλιση με τολουόλιο. 

Δειγματοληψία

Η δειγματοληψία γίνεται κατά προτίμηση μετά από (4 ωρών) νηστεία, αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί και δείγμα άνευ νηστείας. Το μεθυλμαλονικό οξύ επηρεάζεται από την λήψη συμπληρωμάτων βιταμίνης Β12.

1. Φλεβοπαρακέντηση και λήψη περίπου 2 ml ολικού αίματος.

2. Μεταφορά σε φιαλίδιο γενικής αίματος (με EDTA ως αντιπηκτικό).

3. Φυγοκέντρηση για 10 min στις 6000 rpm και λήψη υπερκειμένου (πλάσματος).

4. Αποθήκευση δείγματος σε κατάψυξη (-20^οC) μέχρι την αποστολή.

5. Aποστολή στο εργαστήριο με παγοκύστεις ή πάγο.   

• Ελάχιστη απαιτούμενη ποσότητα δείγματος: 1000 μL ολικό αίμα ή 500 μL πλάσμα
• Συνθήκες μεταφοράς : σε ξηρό πάγο ή με παγοκύστεις

Διαχείριση αποτελεσμάτων

• Χρόνος αναφοράς αποτελεσμάτων : 10 ημέρες από την λήψη του δείγματος.
• Χρόνος συντήρησης των δειγμάτων στο εργαστήριο: 2 μήνες. 

Τιμές αναφοράς

Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται οι φυσιολογικές τιμές στo πλάσμα του Μεθυλμαλονικού οξέος (Methylmalonic acid, MMA) και της ολικής Oμοκυστεΐνης (total Homocysteine, tHCYS), οι οποίες διαφοροποιούνται ανάλογα με την ηλικία. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε μmol/L πλάσματος.

Ποιοτικός έλεγχος

•  Το εργαστήριο εφαρμόζει εσωτερικό ποιοτικό έλεγχο αναλύοντας καθημερινά δείγματα-control (φυσιολογικά και επιφορτισμένα παθολογικά).
• Εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος πραγματοποιείται με συμμετοχή του εργαστηρίου στα Διεργαστηριακά Προγράμματα Ποιοτικού Ελέγχου, του European Research Network for Diagnosis and Treatment of Inherited disorders of Metabolism (ERNDIM): 1. αναλύονται κάθε χρόνο 8  δείγματα (Special Assays in Serum Scheme, SAS) αγνώστου συγκέντρωσηςμε τιμές από φυσιολογικές έως παθολογικές, 2. ERNDIM SAS CONTROL, Level 1-2 .

Επεξήγηση αποτελεμάτων –Αναφορά

Για την ορθή αξιολόγηση των αποτελεσμάτων είναι απαραίτητη η συμπλήρωση ιστορικού το οποίο περιλαμβάνει: Συμπτώματα, φαρμακευτική αγωγή. Η ορθή λήψη και προετοιμασία του δείγματος είναι απαραίτητη για την ορθή εξαγωγή συμπερασμάτων. 

Σε περίπτωση παθολογικού αποτελέσματος, δίνεται αναφορά με λεπτομερή επεξήγηση των αποτελεσμάτων, στοιχεία διαφορικής διάγνωσης και περαιτέρω συμπληρωματικές διαγνωστικές εξετάσεις. 

Βιβλιογραφία

1. Windelberg A., et al. Automated assay for the determination of methylmalonic acid, total homocysteine, and related amino acids in human serum or plasma by means of methylchloroformate derivatization and gas chromatography-mass spectrometry, Clinical Chemistry, 2005, 51:11, 2103-2109.
2. Dai C., et al. A Novel Review of Homocysteine and Pregnancy Complications, Biomed Research Internationa, 2021, 6652231, doi: 10.1155/2021/6652231.
3. Hague W,M, et al. Homocysteine and pregnancy, 2003, Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology,  17: 3, 459–469, doi:10.1053/S1521-6934(03)00009-91.