Υγρή Χρωματογραφία Δίδυμη Φασματομετρία Μάζης (HPLC/UPLC TANDEM MS)
Κατά τη διάρκεια των τελευταίων 15 ετών, η μέθοδος υγρής χρωματογραφίας / φασματομετρίας μάζης(LC-MS / MS) έχει εξελιχθεί σε μια σημαντική τεχνολογία που χρησιμοποιείται για την εκτέλεση αναλύσεων σε πολλά κλινικά εργαστήρια διεθνώς.
Η LC-MS/MS είναι μια ισχυρή ποιοτική και ποσοτική αναλυτική τεχνική με ένα ευρύ φάσμα κλινικών εφαρμογών, συμπεριλαμβανομένης της παρακολούθησης θεραπευτικών φαρμάκων (TDM), της τοξικολογίας, της ενδοκρινολογίας, της παιδιατρικής, της μικροβιολογίας και του αναδυόμενου πεδίου της πρωτεομικής. Το ενδιαφέρον για την κλινική χρησιμότητα της φασματομετρίας μάζας συνεχίζει να αυξάνεται, γεγονός που αποδεικνύεται από τον συνεχώς αυξανόμενο αριθμό δημοσιεύσεων και συνεδρίων LC-MS/MS.
Η τεχνική αυτή είναι εξαιρετικά ακριβής στην ανίχνευση συγκεκριμένων ενώσεων που βρίσκονται σε πολύπλοκα μείγματα όπως το αίμα του νεογνού. Ο ιονισμός των μεταβολιτών πραγματοποιείται με την μέθοδο Electrospray, μία τεχνική ήπιου ιονισμού που επιτρέπει την φασματομετρική ανάλυση πολικών ενώσεων όπως αυτές που ανιχνεύονται στη διερεύνηση μεταβολικών νοσημάτων. Επίσης στην μέθοδο αυτή ιονισμού, η απόκριση του λαμβανόμενου σήματος εξαρτάται από την συγκέντρωση και αυτή η ιδιότητα χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση των μεταβολιτών που ευρίσκονται στο υπό ανάλυση διάλυμα.
Η λειτουργία του φασματομέτρου Μαζών περιλαμβάνει:
- Την παραγωγή ιόντων από τους μεταβολίτες του υπό ανάλυση δείγματος.
- Την επιλογή προδρόμων (Precursor) ιόντων σύμφωνα με την μάζα τους στον πρώτο φασματόμετρο (analyzer) του συστήματος.
- Την διάσπαση των επιλεγμένων προδρόμων ιόντων με την βοήθεια αερίου Αργού, και την δημιουργία παραγώγων ιόντων.
- Την ανάλυση των παραγώγων ιόντων σύμφωνα με την μάζα τους στο δεύτερο φασματόμετρο του συστήματος.
Κλινικές Εφαρμογές της LC-MS/MS
Αρχικά, η φασματομετρία μάζας χρησιμοποιήθηκε κυρίως στον έλεγχο νεογνών και στη διάγνωση οργανικών μεταβολικών διαταραχών σε κλινικά εργαστήρια.
Σήμερα, το LC-MS/MS είναι η κορυφαία τεχνολογία που χρησιμοποιείται από παιδιατρικά εργαστήρια για προγράμματα ελέγχου νεογνών λόγω της ευελιξίας, της ευαισθησίας και της ειδικότητάς της .
Στον τομέα της Διερεύνησης μεταβολικών / ενδοκρινολογικών νοσημάτων η ευαισθησία και ειδικότητα της μεθόδου έχει αποδείξει την αξία της. Μεγάλος αριθμός μεταβολιτών (μεταβολίτες της Βιταμίνης Β6, Βιταμίνης D, στην εκτίμηση του προφίλ Αμινοξέων, Πουρινών-πυριμιδινών , Στεροειδών κλπ) οι σύγχρονες μεθοδολογίες χρησιμοποιούν την Τεχνική LC/MS-Ms η οποία πλέον θεωρείται η μέθοδος αναφοράς.
Η παρακολούθηση θεραπευτικών φαρμάκων είναι ένας άλλος κλάδος στον οποίο οι αναλύσεις LC-MS / MS είναι σημαντικές για την ποσοτική μέτρηση φαρμάκων.
Ένα άλλο πλεονέκτημα των LC-MS/MS έναντι των ανοσοδοκιμών για τη μέτρηση ανοσοκατασταλτικών είναι η ικανότητα αναζήτησης πολλαπλών αναλυτών σε μία αναλυτική διαδικασία. Σε ασθενείς που έχουν συνταγογραφηθεί πολλαπλά φάρμακα – όπως το σιρόλιμους σε συνδυασμό με κυκλοπορίνη Α ή tacrolimus – ή καθώς ένας ασθενής μεταβαίνει από ένα ανοσοκατασταλτικό σε άλλο, εργαστήρια που χρησιμοποιούν LC-MS / MS μπορούν ταυτόχρονα να μετρήσουν και τα δύο φάρμακα σε μία ανάλυση, εξοικονομώντας χρόνο και χρήμα.
Άλλα φάρμακα που παρακολουθούνται συχνά περιλαμβάνουν: αντιεπιληπτικά (π.χ. λαμοτριγίνη, λεβετιρακετάμη), αντιμυκητιασικά (π.χ. ποσακοναζόλη) και αντικαταθλιπτικά (π.χ. αμιτριπτυλίνη).
Αέρια Χρωματογραφία Φασματομετρία Μάζης (GC-MS)
Η αέρια χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (GC-MS) είναι μια αναλυτική μέθοδος που συνδυάζει τα χαρακτηριστικά της αέριας χρωματογραφίας και της φασματομετρίας μάζας για τον εντοπισμό διαφορετικών ουσιών σε ένα δείγμα δοκιμής.
Το GC-MS αποτελείται από δύο κύρια δομικά στοιχεία: τον αεριοχρωματογράφο και το φασματόμετρο μάζας. Αυτά τα δύο συστατικά, που χρησιμοποιούνται μαζί, επιτρέπουν έναν πολύ λεπτότερο βαθμό ταυτοποίησης της ουσίας από οποιαδήποτε μονάδα που χρησιμοποιείται ξεχωριστά.
Αρχή της χρωματογραφίας
Τεχνική διαχωρισμού σε διαφορετικό χρόνο:
- Εισαγωγή μίγματος
Χρόνος έκλουσης
Ποιοτική πληροφορία
Ύψος ή εμβαδόν κορυφών
Ποσοτική πληροφορία
Ο αεριοχρωματογράφος χρησιμοποιεί μια τριχοειδή στήλη της οποίας οι ιδιότητες όσον αφορά το διαχωρισμό των μορίων εξαρτώνται από τις διαστάσεις της στήλης (μήκος, διάμετρος, πάχος μεμβράνης) καθώς και από τις ιδιότητες φάσης.
Η διαφορά στις χημικές ιδιότητες μεταξύ διαφορετικών μορίων σε ένα μείγμα και η σχετική συγγένειά τους με τη στατική φάση της στήλης θα προωθήσει τον διαχωρισμό των μορίων καθώς το δείγμα ταξιδεύει στο μήκος της στήλης. Τα μόρια συγκρατούνται από τη στήλη και στη συνέχεια εκλούονται (βγαίνουν) από τη στήλη σε διαφορετικούς χρόνους (που ονομάζεται χρόνος κατακράτησης) και αυτό επιτρέπει στο φασματόμετρο μάζας κατάντη να συλλάβει, να ιονίσει, να επιταχύνει, να εκτρέψει και να ανιχνεύσει τα ιονισμένα μόρια ξεχωριστά. Το φασματόμετρο μάζας το κάνει αυτό σπάζοντας κάθε μόριο σε ιονισμένα θραύσματα και ανιχνεύοντας αυτά τα θραύσματα χρησιμοποιώντας την αναλογία μάζας προς φορτίο.
Η εξαιρετική δυνατότητα διαχωρισμού πολλών ουσιών από ένα σύνθετο μείγμα όπως είναι τα Βιολογικά Υγρά την καθιστά πολύτιμη στην διερεύνηση μεταβολικών νοσημάτων στα οποία απαιτείται η ταυτόχρονη ανίχνευση και ποσοτικοποίηση πολλών χημικών ενώσεων.
Χαρακτηριστικό παράδειγμα αυτής της δυνατότητας είναι η ανάλυση Οργανικών Οξέων στα ούρα ασθενούς, όπου ανιχνεύονται και ποσοτικοποιούνται πάνω απο 100 ενώσεις του διάμεσου μεταβολισμού.
Υγρή Χρωματογραφία Ηλεκτροχημική Φθοριομετρική Ανίχνευση
Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), που παλαιότερα αναφερόταν ως υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης, είναι μια τεχνική στην αναλυτική χημεία που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό, την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό κάθε συστατικού σε ένα μείγμα. Βασίζεται σε αντλίες για να περάσει ένας υγρός διαλύτης υπό πίεση που περιέχει το μείγμα δείγματος μέσω μιας στήλης γεμάτης με ένα στερεό προσροφητικό υλικό.
Η ανίχνευση και ποσοτικοποίηση των ενώσεων που διαχωρίζονται πραγματοποιείται σε ειδικά όργανα –ανιχνευτές που χρησιμοποιούν τις φυσικοχημικές ιδιότητες των μορίων (απορρόφηση φωτός, φθορισμός, οξειδοαναγωγικές ιδιότητες κλπ).
Φθοριομετρική ανίχνευση
Σε ορισμένες περιπτώσεις, όταν η φωτεινή ενέργεια απορροφάται από ένα μόριο, ανυψώνει μερικά από τα ηλεκτρόνια σε διεγερμένη κατάσταση. Όταν αυτά τα ηλεκτρόνια επιστρέφουν στην κατάσταση του εδάφους και εκπέμπεται φως, η διαδικασία αναφέρεται ως φθορισμός. Οι ανιχνευτές φθορισμού βασίζονται σε αυτή τη μοριακή ιδιότητα για ανίχνευση.
Ηλεκτροχημικός (αμπερομετρικός) ανιχνευτής
Παρακολουθείται η ένταση ρεύματος (i) μικρού ηλεκτρολυτικού στοιχείου ροής, διαφόρων μορφών, με εφαρμογή επιλεγόμενου σταθερού δυναμικού (Ε). Χρησιμοποιείται σε διαχωρισμούς ηλεκτρενεργών ουσιών (ικανών να αναχθούν ή οξειδωθούν) στο ηλεκτρόδιο εργασίας, στην επιλεγόμενη τιμή δυναμικού.
Χαρακτηριστικά:
- Εξαιρετική ευαισθησία
- Εφαρμογή σε ενώσεις βιοχημικού και φαρμακολογικού ενδιαφέροντος – Π.χ. ιχνοποσότητες κατεχολαμινών στον εγκέφαλο
- Στην ανίχνευση ενώσεων που σχετίζονται με το μεταβολισμό, χρησιμοποιείται σε εφαρμογές υψηλής ευαισθησίας όπως η ανάλυση Κατεχολαμινών σε Βιολογικά Υγρά, η μέτρηση Βιογενών Αμινώ στο Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό κλπ.
